摘要：目的 利用CRISPR/Cas9技术建立肠癌抑制基因Mindin的稳定敲除细胞株。方法 针对Mindin基因编码序列设计三个向导RNA（sgRNA），将表达sgRNA和Cas9蛋白的质粒共同电转进小鼠成纤维细胞L929中，加入药物筛选获得细胞库。测序检测细胞库基因组的突变效率，并从高突变细胞库中挑取单克隆进一步培养与鉴定。结果 三个sgRNA都能介导CRSIPR/Cas9高效编辑Mindin基因靶位点，从中挑选得到Mindin基因缺失并可稳定遗传的L929细胞株。结论 我们得到了一个稳定敲除Mindin基因的L929细胞株，为后续研究Mindin基因在肠癌发生与发展过程中的作用提供了必要的研究素材，为其动物模型的建立打下坚实的基础。
关键词：CRISPR/Cas9；基因敲除；Mindin
中图分类号：Q7 文献标识码：A
CRISPR/Cas9是近年来从古细菌免疫系统中发展起来的一种新型高效的基因组编辑技术，利用人工设计的sgRNA介导外源表达的Cas9核酸酶与基因组靶点特异性结合从而实现对靶序列的特异性切割，进而诱导细胞通过非同源末端连接或同源重组方式来修复断裂的DNA双链[1-2]。非同源末端连接的修复效率高于同源重组的修复效率，但易形成错配修复，从而在切割位点引入序列的缺失或插入，引发靶点基因编码的蛋白发生移码突变从而实现对靶点基因的敲除。当存在同源片段时，断裂的DNA链可能发生同源重组修复，将外源片段整合到基因组中，从而实现基因的敲除、敲入及突变等[2-3]。
Mindin是一种高度保守的分泌性细胞外基质蛋白[4]，我们研究发现，Mindin是肠癌发病过程中重要的抑癌基因。由于前期对其功能研究的主要手段为RNA干扰技术，是在转录后水平降低蛋白的表达，其瞬时性和不彻底性会影响对其功能的深入研究。因此，我们迫切需要利用CRISPR/Cas9技术在基因水平上完全敲除Mindin基因并筛选出可稳定遗传的细胞株，为进一步深入研究Mindin在肠癌发生与发展过程中的作用提供有力的细胞模型支持。
1 资料与方法
1.1一般资料 L929细胞株（小鼠成纤维细胞株）由厦门大学李勤喜教授实验室馈赠；pUC57-sgRNA质粒载体（Addgene 51132）以及pST1374-Cas9-NLS表达质粒由上海科技大学黄行许教授馈赠；pBKS质粒由厦门大学林圣彩教授实验室馈赠。sgRNA寡聚核苷酸链引物由厦门安特奥生物有限公司合成；单克隆引物由上海生工生物有限公司合成；质粒测序及单克隆菌液测序由厦门闽博生物有限公司完成。
1.2方法
1.2.1质粒构建 针对Mindin基因编码序列设计三个sgRNA作用靶点，合成寡聚核苷酸链，序列如下：
F1：5’-TAGGactgtgcagggggccggaac-3’& R1：5’-AAACgttccggccccctgcacagt-3’
F2：5’-TAGGcctgccatccctagcggtac-3’& R2：5’-AAACgtaccgctagggatggcagg-3’
F3：5’-TAGGaagtctgcccggtaccgcta-3’& R3：5’-AAACtagcggtaccgggcagactt-3’
寡聚核苷酸序列5’端TAGG和AAAC碱基为pUC57-sgRNA质粒载体通用粘性末端。合成的寡聚核苷酸链利用PCR仪退火后连接入经Bsa I酶切的pUC57-sgRNA载体，构建sgRNA表达质粒。所得质粒通过测序检验连入片段的正确性。
1.2.2细胞的转染与筛选 将测序正确的pUC57-sgRNA质粒载体连同pST1374-Cas9-NLS质粒载体利用电转仪电转入消化好的L929细胞中，待细胞贴壁生长后换液并加入杀稻瘟菌素（Blasticidin）进行筛选，即可获得细胞库。从细胞库中提取基因组DNA，测序鉴定突变情况。
1.2.3单克隆的挑选与扩增 待对照组细胞全部死亡后，将实验组细胞利用DMEM培养液进行梯度稀释，分装至96孔板中培养，10 d后，于显微镜下观测各孔细胞生长情况，确定真正的单克隆细胞，进行后续培养分析。
1.2.4细胞基因组提取与鉴定 将待鉴定的细胞加入含蛋白酶K的DNA Digestion Buffer（Jackson Lab）中56℃消化过夜，利用酚氯仿抽提法提取细胞基因组DNA。利用单克隆引物TA-F1：5’-tgagtcttgccctgggcaga-3’&TA-R1：5’-agctactgtgccctccaaca-3’和TA-F2： 5’-atgcagtcaggcctttgca-3’& TA-R2：5’-acaggtccagactgtcgat-3’进行PCR扩增，所得DNA片段通过连接酶非依赖的克隆构建方法（Ligase independent clone，LIC）将其连入利用BamH I和Xho I酶切好的pBKS质粒载体中，挑选单克隆菌落进行测序分析。
2 结果
2.1 sgRNA的设计和打靶载体的构建 针对Mindin基因组中蛋白编码序列，我们利用MIT张锋教授实验室提供的在线软件分析了所有的可能sgRNA位点（PAM序列为NGG），从中挑选出三个评分最高的sgRNA位点，设计并合成寡聚核苷酸链。合成的寡聚核苷酸链利用PCR仪退火后连接入经Bsa I酶切的pUC57-sgRNA载体，构建sgRNA表达质粒。通过测序证实插入片段正确。
2.2 sgRNA效率的检测 实验组和对照组转染完24 h后加入杀稻瘟菌素处理，待对照组细胞全部死亡后，将实验组剩下的细胞继续培养至24孔板中。利用酚氯仿抽提法提取细胞基因组进行PCR扩增并测序。三个sgRNA位点的突变情况，见表1，所有测序的克隆均发生不同程度的突变。 2.3 Mindin基因敲除单克隆细胞的获得 根据细胞库敲除的情况，我们挑选了sgRNA位点3的细胞库进行单克隆分选。用培养基稀释的细胞培养14天后，于显微镜下挑选正确的单克隆提取基因组DNA，利用单克隆测序引物TA1或TA2进行测序。其中所获得的第23号单克隆缺少了10bp，是一株Mindin基因敲除并可稳定遗传的细胞。而所获得的第12号单克隆缺失了3bp，是一种不会改变后续阅读框的突变，可以用于当作对照组细胞株，见图1。
图1 Mindin敲除的单克隆细胞基因组测序结果
3 讨论
基因组编辑是研究基因功能以及进行基因治疗的重要手段，人工核酸酶技术的出现为基因组编辑提供了强有力的工具。CRISPR/Cas9作为新一代的基因组编辑核酸酶技术，其对靶位点的识别依赖于sgRNA 5’端与靶位点DNA序列间的互补配对，针对不同靶点序列的sgRNA仅需替换识别位点处20bp的序列即可，应用时简单易行，具有显著的优势，成为目前生命医学领域的研究热点。
真核生物基因组DNA具有复杂的高级结构，并且组蛋白上经常会发生各种修饰，故而寻找高效的sgRNA位点是确保CRISPR/Cas9系统有效工作的重要前提。为了探究如何获得高效的sgRNA，在本研究工作中，我们挑选了肠癌抑制基因Mindin作为靶基因，利用已有的设计软件，构建了针对Mindin基因的三条sgRNA，并将其导入鼠源L929细胞中，检测sgRNA的效率。结果表明，所挑选的三条sgRNA都能高效的介导基因组编辑，细胞库内测序的所有克隆都发生了突变，并且突变位点都位于sgRNA后NGG序列附近，证明了这三条sgRNA都可以介导Cas9蛋白高效切割Mindin基因靶序列。从细胞库中分离得到的不同单克隆细胞株进一步证实了这种基因组编辑可以稳定遗传的。由此，我们得到了一个稳定敲除Mindin基因的L929细胞株，为后续研究Mindin基因在肠癌发生与发展过程中的作用提供了必要的研究素材。此外，我们设计出的高效sgRNA位点也可用于Mindin基因敲除动物的制备，为其动物模型的建立打下坚实的基础。
参考文献：
[1]Barrangou R，Fremaux C，Deveau H，et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.Science 2007；315（5819）1709-12
[2]Cong L，Ran FA，Cox D，et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science，2013，339（6121）：819-823.
[3]卢利莎，白杨，刘鑫，等.利用CRISPR/Cas9技术构建敲除MEIS2基因的HEK293T人胚肾细胞系[J].中国细胞生物学学报，2015，37（4）：535C541
[4]Higashijima，S.i.A.Nose，et al.Mindin/F-spondin Family：Novel ECM Proteins Expressed in the Zebrafish Embryonic Axis[J].DEVELOPMENTAL BIOLOGY，1997，192（2）：211-227.
