【摘 要】以生L快、易繁殖的旱柳 （Salix matsudana Koidz）为实验材料进行水培，分别设置对照组、5mmol/L Ca组、50μmol/L Cd组、5mmol/L Ca+50μmol/L Cd组，培养28天后测定各组旱柳叶片和根系的抗氧化酶活性，以了解Cd胁迫下外源Ca对旱柳无性系植株抗氧化酶活性的影响。实验结果显示：（1）处理28天后，旱柳叶中SOD活性为50μmol/L Cd组>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd组>5mmol/L Ca组>对照组，根中为对照组>5mmol/L Ca组>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd组>50μmol/L Cd组；旱柳根和叶POD的活性均表现为：50μmol/L Cd组>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd组>5mmol/L Ca组>对照组；旱柳根和叶CAT 的活性均为对照组>5mmol/L Ca组>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd组>50μmol/L Cd组。（2）5mmol/L Ca+50μmol/L Cd组由于Ca的添加，与50μmol/L Cd组相比，旱柳SOD和POD的活性降低，CAT的活性升高，证明外源Ca能缓解Cd对旱柳的胁迫作用。
【关键词】旱柳；Cd；Ca；抗氧化酶
中图分类号： Q945 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）12-0085-004
DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.12.037
Effects of Ca on Antioxidant Enzyme Activities of Salix matsudana Koidz Clones Under Cd Stress
LI Chong-hao SHANG Xiao-shuo OUYANG Jie LI Bin-bin ZHAI Ya-zhen LIU Xiang-jun ZOU Jin-hua*
（College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， Tianjin 300387，China）
【Abstract】Fast-growing and easily-breeding Salix matsudana Koidz was used as the experimental material. Four groups of S. matsudana by hydroponic cultivation were set： the control group， 5mmol/L Ca treatment group， 50μmol/L Cd treatment group， and 5mmol/L Ca +50μmol/L Cd treatment group. After28days of cultivated， the antioxidant enzyme activities of leaves and roots of S. matsudana in each group were determined， and the effects of exogenous Ca on antioxidant enzyme activities of S. matsudana clones under Cd stress were studied. The results showed that： （1） 28 days later， the order of SOD activities in leaves was： 50μmol/L Cd treatment group>5mmol/L Ca+50μmol/L treatment group>5mmol/L Ca treatment group>control group， and the order of SOD activities in root was： control group>5mmol/L Ca group>5mmol/L Ca+50μmol/L treatment group>50μmol/L Cd treatment group； the order of POD activity in both roots and leaves was： 50μmol/L Cd treatment group>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd treatment group>5mmol/L Ca treatment group>control group and the activity of CAT was： control group>5mmol/LCa treatment group>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd treatment group>50μmol/L Cd treatment group. （2） Compared with 50μmol/L Cd treatment group， the activity of SOD and POD were decreased， however， the activity of CAT increased in the 5mmol/L Ca+50μmol/L Cd treatment group. Therefore， it was proved that exogenous Ca can relieve the stress of Cd on S. matsudana.
【Key words】Salix matsudana Koidz； Cd； Ca； Antioxidant enzymes 随着工农业的迅速发展，大量含有重金属的工业废水、生活垃圾造成严重的环境污染，重金属还可通过食物链进入人体，危害健康。重金属镉（Cd）因其毒性高和移动性大而备受关注，Cd对植物有毒害作用，抑制植物的生长，影响植物细胞膜透性、抗氧化酶活性、光合作用以及植物器官对营养元素的吸收等[1]。
Cd毒性较强，尤其是在酸性土壤中，Cd更易于被植物体吸收积累，最终成为含镉植物，进而通过食物链的传播转移至人体内，威胁人类的健康。Cd会刺激人体的呼吸道，长时间暴露会导致嗅觉丧失症、牙龈有黄斑或渐成黄圈等症状[2]。
外界环境中的Cd主要来源于自然因素和人类活动。Cd主要以两种形式对土壤造成污染：一种形式是工业废气中的Cd随着风扩散，经过空气中自然的沉降作用，积累于工厂周围的土壤中；另一种形式是用含Cd的工业废水、生活废水等灌溉农田，使土壤受到严重的Cd污染。植物净光合速率、蒸腾速率、气孔导度等随着Cd胁迫浓度的增加而下降，导致植物营养失衡和超微结构损伤[3]，同时导致植物体内的活性氧自由基含量增加，加速植物的衰老，降低植物产量。
钙（Ca）是植物生长发育所必需的一种大量元素，是重要的调节因子，植物从氯化钙等盐类中吸收Ca离子。Ca主要存在于植物的叶片和衰老的组织器官中，它是一个不容易移动的元素。Ca在生物膜系统中可以作为磷脂的磷酸根和膜蛋白的羧基之间的桥梁，可以保持生物膜的稳定[4]。
缺Ca时会阻碍植物细胞壁的形成，影响细胞的有丝分裂过程，或者不能形成新的细胞壁，产生多核细胞[5]。缺Ca会抑制植物的生长，严重时会导致植物的幼嫩器官化脓坏死。外源Ca能在一定程度上减轻高温、低温、缺水、盐害等逆境对植物造成的伤害[6]。适量的Ca可增强旱柳对Cd胁迫的抗性，Ca可以通过抑制植物对Cd的吸收，促进可溶性蛋白、可溶性糖和光合色素的合成，维持高的抗氧化物质含量、矿质营养平衡和总抗氧化能力来增强旱柳对Cd胁迫的抗性[7]。
Cd胁迫下，旱柳会受到氧化胁迫，为抵御活性氧化物的毒害作用，旱柳体内的抗氧化酶活性会发生一系列的变化[8]。活性氧清除系统包括三种重要的抗氧化酶：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）。SOD是活性氧清除系统的第一道防线，其作用为清除超氧阴离子，把超氧阴离子转化为H2O2和O2。植物体内的抗氧化能力越强，在受到Cd胁迫时其SOD活性越高，所以植物体内SOD活性的大小标志着植物抗氧化能力的强弱[9]。
POD在植物体内广泛存在，其活性在植物幼嫩组织中较低，衰老组织中较高，因此可以用POD的活性来判断植物的老化程度[10]。与SOD类似，POD在植物细胞中也可以清除活性氧自由基，减轻Cd胁迫对植物体造成的伤害。
CAT也是植物体内一种重要的清除剂。CAT可以催化植物中的过氧化氢分解为氧气和水，主要存在于某些组织的过氧化物体内，使细胞免于遭受过氧化氢的毒害。
旱柳（Salix matsudana Koidz）是我国重要的优良造林树种之一。旱柳的光合速率高，根系较发达，生长速度快，繁殖容易，采用扦插等无性繁殖的方法容易成活，根茎修剪后容易萌发新枝，对生态环境具有较强的适应性和抗逆性，适用于植物修复[11-12]。
本次实验主要研究外源Ca对Cd胁迫下旱柳无性系抗氧化酶活性的影响，探讨Cd胁迫下抗氧化酶在防御系统中所起的作用，为旱柳在植物修复中的研究提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料的培养与处理
本实验采用天津师范大学生物科技园内的旱柳作为实验材料，选取相对较粗的长势一致的旱柳枝条，修剪成约15cm的短枝，分成四组，每组20枝固定在打好孔的泡沫板上。在含蒸馏水的塑料盆中室温下培养，每24h换一次水。当枝条培养至根长约10cm且萌发出叶片后，添加1/2Hoagland营养液并进行实验处理。只添加了1/2Hoagland营养液的为对照组，其他三组分别置于浓度为5mmol/L Ca、50μmol/L Cd、5mmol/L Ca+50μmol/L Cd的营养液中培养28天。处理期间，每天观察旱柳枝条的生长状r，每七天更换一次营养液，并及时添加蒸馏水以补充叶片蒸腾作用失去的水分。
1.2 抗氧化酶的活性测定
按照李合生[13]、Zhang[14]等人的实验方法测定SOD、POD、CAT活性。并按下列公式计算酶活性。
SOD活性（U/g）=
■
POD活性（U/g）=
■
CAT活性（U/g）=
■
2 实验结果
2.1 外源Ca对Cd胁迫下旱柳根和叶中SOD活性变化
图1 显示了28天后不同处理条件下旱柳叶片和根系中SOD活性的变化。结果显示，在整个处理过程中，叶片中的SOD活性在50μmol/L Cd处理组中最高，其次是5mmol/L Ca+50μmol/L Cd处理组>5mmol/L Ca处理组>对照组，对照组的SOD活性处于最低，且各处理组之间酶活性变化显著。说明50 μmol/L Cd处理对旱柳的毒害作用最大，SOD的活性的提高可以减轻Cd对旱柳的氧化损伤，施加外源Ca后的SOD酶活性比50μmol/L Cd处理时SOD酶活性降低。与叶片不同的是，旱柳根系中的SOD活性在对照组中最高，顺序为5mmol/L Ca处理组>5mmol/L Ca +50μmol/L Cd处理组>50μmol/L Cd 处理组，在50μmol/L Cd处理时酶的活性最低，说明随着50μmol/L Cd胁迫程度的加强，旱柳根系中SOD的活性逐渐降低，加入外源Ca后有效缓解了Cd的胁迫作用。
2.2 外源Ca对Cd胁迫下旱柳根和叶中POD活性变化 图2 显示28天后不同处理条件下旱柳叶片和根系中POD的活性变化。结果显示，对照组中旱柳叶片的POD活性与其他组相比处于最低，且与Ca处理组相比变化幅度较小。各处理组中POD的活性为50μmol/L Cd处理组中最高，其次是5mmol/L Ca+50μmol/L Cd处理组和5mmol/L Ca处理组，对照组中POD活性最低，施加外源Ca后比50μmol/L Cd处理时POD的活性降低。φ兆橹泻盗根系的POD活性与其他组相比始终处于最低，整体变化为50μmol/L Cd处理组>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd处理组>5mmol/L Ca处理组>对照组，说明Cd胁迫下旱柳受到严重伤害，施加了Ca后比50 μmol/L Cd处理时POD活性下降，说明外源Ca可以有效缓解Cd的胁迫作用。
2.3 外源Ca对Cd胁迫下旱柳根和叶中CAT活性变化
图3 显示28天后不同处理条件下旱柳叶片和根系中CAT的活性变化。结果显示，旱柳叶片中的CAT活性始终大于根系，且处理28天后各实验组之间CAT活性差异显著。在叶片中对照组CAT的活性最高，其次是5mmol/L Ca处理组>5mmol/L Ca +50μmol/L Cd 处理组>50μmol/L Cd处理组，在Cd处理时酶活性达到最低，说明Cd胁迫下会明显抑制旱柳叶片内CAT的活性，而外源Ca的加入则减缓了Cd对旱柳叶片CAT活性的抑制作用。在旱柳根系中CAT的活性较低，整体顺序为对照组>5mmol/L Ca处理组>5mmol/L Ca+50μmol/L Cd处理组>50μmol/L Cd处理组，外源Ca的加入显著缓解了Cd对旱柳根系的毒害作用。
3 讨论
Cd是植物细胞生长的非必需元素，但Cd是毒性最强的重金属元素之一，当Cd进入到植物体内并积累到一定程度时，就会对植物体产生很强的毒害作用[15-16]。Cd会刺激植物体产生活性氧（ROS），ROS导致蛋白质氧化，对植物体产生氧化胁迫，使植物的细胞膜受到伤害，这是其产生毒性的主要原因。Cd在植物体内主要以与蛋白质结合的形式存在，高剂量的Cd会干扰植物的正常形态和生长发育[17]，使植物新长出的叶片发黄失绿，还会抑制植物根系的生长，使植物根的侧根减少，产生褐变，此外，旱柳幼嫩细胞细胞壁中的纤维素、果胶和糖蛋白等化合物形成的网孔，对于植物吸收积累Cd元素均起到了很大作用[18]。Cd被植物体吸收后，会在植物体内积累迁移，破坏植物根部，干扰植物的正常代谢，还会通过拮抗作用和协同作用影响植物体对其他元素的吸收利用，进而影响植物体内一系列的生理生化代谢活动，加速植物的衰老过程[19]。
Ca是植物体必须的营养元素之一，Ca可以调节细胞的粘性和渗透性，能维持细胞的正常形态和生理状态，还参与植物细胞中蛋白质合成，酶的代谢等过程，是多种酶的组成成分和激活剂。研究表明，Cd的毒害作用干扰了植物细胞内Ca代谢，致使Ca在细胞中不正常的分布，Ca的稳态机制由此被破坏，施用外源Ca可以增加植物细胞内部Ca的含量，细胞内的 Ca 通过与钙调素的结合来调节细胞的代谢过程，从而减轻了Cd胁迫对植物体造成的危害[20]。在本次实验研究中，施加一定浓度的外源Ca后，随着植物体内 Ca 浓度的增加以及Cd和Ca的拮抗作用，使Cd对旱柳胁迫的毒性减弱，对Cd的吸收也大幅度下降，同时增强旱柳体内的防御系统，使旱柳对各种营养元素的吸收也回归正常[21]。
当旱柳受到Cd胁迫时，体内会产生活性氧自由基，造成细胞叶绿体和线粒体膜的损伤，破坏细胞的代谢平衡，引起植物产生氧化胁迫和膜质过氧化，会抑制植物生长甚至导致植物死亡[22]。在正常情况下，植物体可以抑制活性氧的产生而使其保持在最低水平，降低其对植物的毒害作用。旱柳体内有多种抗氧化酶能降低ROS的伤害，其活性的提高是一种急性解毒措施。在Cd胁迫的条件下SOD、POD、CAT 的活性因抗性不同而异。SOD是抗氧化酶系统在植物体内清除活性氧过程中的第一道防线，是植物体内重要的抗氧化酶，能有效清除植物体内的超氧自由基，使之歧化为H2O2，防止生物膜脂质过氧化，对生物膜起到了保护作用[23]。在本次实验研究中，旱柳叶片在50μmol/L Cd胁迫下SOD的活性显著增加，可能是因为旱柳体内超氧阴离子自由基的增加引起编码SOD的基因大量表达导致酶活性的提高。在施加了外源Ca后，旱柳体内SOD的活性较对照组高，说明外源Ca可能会通过提高旱柳体内SOD活性来减轻Cd胁迫对旱柳叶片造成的氧化损伤。旱柳根系在50μmol/L的Cd胁迫下SOD的活性达到最低，说明旱柳的根系比叶片敏感，过多的活性氧自由基破坏了细胞内的多种功能膜及酶系统，使SOD的活性受到抑制而急剧下降。
POD也是植物体内的抗氧化酶之一，被认为是对外界环境条件的变化反应灵敏的一种酶。POD的活性可以在植物体生长发育的过程中和对外界逆环境的适应性中体现，可通过愈创木酚作为电子供体在氧化过程中清除H2O2，将有毒的H2O2变为无毒的水，维持细胞低水平自由基，减轻逆境对植物体造成的伤害[24]。本实验结果显示，Cd处理组中POD的活性高于对照组，说明旱柳体内具有形成抗氧化酶防御系统的潜能，可以适应一定浓度的Cd胁迫。POD活性的增加是由于在Cd的胁迫下，旱柳体内产生了H2O2，以及SOD在清除超氧阴离子自由基时产生的一小部分H2O2，过量的H2O2导致了旱柳体内 POD基因的大量表达。过氧化氢酶（CAT）能够将H2O2转化为H2O和O2，在植物体内起清除 H2O2的作用。但实验结果表明，CAT的活性在对照组中最高，随着伤害的增大数值逐渐降低，在单一Cd处理组中达到最低，说明Cd的胁迫会降低旱柳体内CAT的活性，而外源Ca的施加会减缓Cd对酶活性的抑制作用，维持植物的正常生长。
4 结论
综上所述，本次研究获得以下结论：Cd胁迫会增加旱柳叶片中SOD活性和POD的活性，而CAT的活性降低。在旱柳根系中，Cd的胁迫降低了SOD和CAT的活性，增加了POD的活性。Cd胁迫下，外源Ca的施加能提升三种抗氧化酶的活性从而起到缓解Cd毒害作用。因此深入了解外源Ca与Cd拮抗作用，对于修复重金属污染土壤，保护环境和提高植物抗性都具有重要意义。 【参考文献】
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