造纸废水中含有大量的内分泌干扰物，常规的污水处理技术未能去除所有的内分泌干拢物。因此，随造纸废水排放进入环境的内分泌干扰物问题也逐渐引起了人们的高度重视。国外陆续报道了造纸废水具有内分泌干扰效应，如在其排放口的下游发现了雄性化的雌性食蚊鱼，这些鱼的卵巢发育受抑制，性激素水平下降，雌鱼出现雄性的繁殖行为。此外,经现代工艺处理后的造纸废水排放口下游也同样发现了这种变异的鱼。对造纸废水进行有关内分泌干扰效应的研究成为一项紧迫的任务。目前研究得较多的是采取化学手段对其中的污染物进行分析。如Jenkins 等在发现有雄性化雌性食蚊鱼的河流中检测到化合物雄烯二酮(4-androstene-3,17-dione,AED)和孕酮(progesterone)。然而，利用植物作为原材料的造纸废水中含有大量的植物甾醇素(phytosterol)[7]以及其它小分子化合物，化学分析较难对废水中众多的污染物进行一一定量。而生物测试方法由于其灵敏、简便、快速，并能综合评价的环境样品的内分泌干扰效应，已广泛的被应用于环境水样的内分泌干扰检测。
广东省四会市邓村地处广东省北部，该地采用古法造纸工艺进行制浆造纸。研究发现，受竹浆造纸废水所污染的邓村河道中出现了明显雄性化的雌性食蚊鱼，同时检测到雄烯二酮、孕酮等化合物，表明造纸废水的排放造成了当地环境类雄激素物质的污染。本研究采用重组人雄激素受体基因酵母及重组人雌激素受体基因酵母对广东四会市邓村河水体中的雌激素效应、雄激素效应和抗雌激素效应进行检测，以期对广东四会市邓村河水体中的内分泌干扰物排放水平进行估算，并对制浆造纸废水的环境激素污染效应进行安全评价，为造纸废水的环境治理提供依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集与前处理
于邓村河造纸废水排放点的下游和上游分别选取了REF、A、B、C 4 个采样点，A、B、C 采样点分别位于邓村造纸作坊的下游，对照点(REF)为不受造纸废水污染的位点，绥江是邓村河与对照位点河流汇入的河流。样品采集的时间为2009 年8 月(夏季)。采样地点如图1 所示。以棕色玻璃瓶采集各1 L 水样(3 次平行)，然后取同一断面水平面0.5 m 以下左、中、右3个点混合样。水样立即加入50 mL 甲醇(色谱纯)和400 L 4 mol/L H2SO4，置于4 ℃冰盒中运回实验室，并于48 h 内进行前处理。使用水质参数仪测定各采样点水质参数，如pH 值、温度、硬度和DO 值。取3 瓶(平行取样)1 L 水样，过GF/F 滤膜。HLB固相萃取柱分别加入10 mL 甲醇和10 mL Milli-Q活化，10~15 mL/min 过HLB 柱;加入250 mL 5%的甲醇水溶液润洗采样瓶，并将润洗溶液过HLB 柱。擦干固相萃取装置内的水分，以锡纸轻轻覆盖HLB 柱，抽干2 h;以4 mL 和3 mL 甲醇(色谱纯)先后洗脱HLB 柱，再以3 mL 和2 mL 二氯甲烷(色谱纯)先后洗脱HLB 柱;合并洗脱液于N2 下轻轻吹干，以1 mL甲醇(色谱纯)重新定容，过0.22 m 有机相滤膜，转移至2 mL 的棕色小瓶中，于-18 ℃保存。
1.2 酵母菌的冻存与复苏
本研究用于雌激素活性筛选(Yeast estrogenscreening，YES) 实验所用的YES 酵母菌和雄激素活性筛选(Yeast androgen screening, YAS)的YAS 酵母菌均由英国Dr. J P Sumpter 提供(Brunel University,Uxbridge, UK)，其中雌激素效应和抗雌激素效应采用YES 酵母菌测试，雄激素效应采用YAS 酵母菌测试。SC 培养基添加硫酸酮、色氨酸、腺嘌呤、赖氨酸。30℃、150 r/min 条件下将1 mL 新鲜冻融的酵母菌液加入到30 mL 培养液中培养过夜。取过夜培养的菌液稀释10 倍于600 nm 处测定吸光度值，向培养基中加入无菌甘油，以1 mL 分装于EP 管中，逐步降温，最后保存在-80 ℃冰箱中。
1.3 重组基因酵母测试
1.3.1 雌激素与抗雌激素活性物质筛选
YES 实验的操作步骤按照赵建亮的方法，两个平行的样品各自在96 孔板上稀释，依次以甲醇进行2倍稀释，每个样品稀释8 次，吸取10 L 稀释后的样品到另外一个96 孔板的相应的孔位置上，待溶剂挥发干。然后准备适量的生长培养基，接种在一天前培养的酵母溶液(620 nm 吸光度为1 左右比较适合接种)。再加入CPRG(氯酚红-D-半乳糖苷)，使之浓度为0.1mg/mL。微孔板以胶带密封好，并以锡纸完全包好，于微孔板振荡器上600 r/min 震荡2 min，使样品与酵母细胞溶液完全混合，然后置于32C 恒温培养72 h，其中在24 h 时再次震荡2 min。最终以酶标仪(BMGLab technologies，Offenburg, Germany) 在620 nm 和540 nm 测定吸光度。E2(雌二醇)作为阳性控制，同时也作为标准曲线，微孔板上E2 的初始浓度为2.7 g/L (0.01 mol/L)，纯甲醇样品作为空白。激素E2 的YES 实验、甲醇空白和只加60%最大雌激素效应的E2 同时进行。
抗雌激素活性的筛选(Yeast anti -estrogenscreening, YAES )实验以他莫昔芬(TAM)作为阳性对照物质。首先在96 孔板的每一个孔内加入浓度为1.36 g/L 的E2 10 L(60%的最大雌激素效应所对用的E2 浓度)，然后加入10 L 从最大浓度为742mg/L 依次2 倍稀释的TAM 甲醇溶液，待溶剂挥发干后，按照YES 实验方法进行。YAES 实验时，雌激素E2 的YES 实验、甲醇空白和只加60%最大雌激素效应的E2 同时进行。
1.3.2 雄激素活性物质筛选
以DHT 为雄激素活性筛选(Yeast androgen screening,YAS)实验的标准对照物质，准备DHT 起始浓度为581 g/L 的标准溶液(甲醇溶液，2mol/L)，在96 孔板上依次稀释，方法同YES 实验，所用菌种为重组雄激素受体基因的酵母菌，亦由英国Dr. J PSumpter 提供(Brunel University, Uxbridge, UK)。酵母菌的接种、培养和吸光度检测按照文献方法进行，所有操作步骤与YES 实验相同，所不同的只是培养条件，接种样品后于32 ℃恒温培养24 h 之后，转移至28 ℃恒温培养12 h，测定吸光度。甲醇空白实验同时进行。
1.4 数据分析
EEQ 根据文献Beck报道方法计算。正常情况下实际样品应当与标准物质E2 具有相同的剂量效应关系。E2 的标准曲线表达为平行样品绝对吸光度的算术平均值(减去纯甲醇的空白值)与剂量的对数(相应的ng/L)。雄激素DHT 的标准曲线采用Sigmaplot10.0 软件以log-logistic 模型拟合。
1.5 质量控制
在雌激素和抗雌激素当量测定实验前，对对照点REF 点水样加入54.48 ng E2 (加入54.48 L 1 mg/L的E2 储液)标准样品，提取时与样品同时进行，最后测得的EEQ 和TEQ 值在42~60 ng 之间。在雄激素当量测定实验前，对对照点REF 点水样加入500 ngDHT (加入50 L 10 mg/L 的DHT 储液)标准样品，提取时与样品同时进行，最后测得的DEQ 值在400~600 ng 之间。
2 结果
2.1 雌激素当量浓度EEQ
体外雌激素效应测定结果，本研究设4 个采样点，REF 采样点雌激素当量值EEQ (E2 equivalents)为3.68 ng/L，A 采样点EEQ 值最高，为20.03 ng/L，B 点为15.332 ng/L，C 点为13.27 ng/L，均比对照采样点高。
2.2 抗雌激素当量浓度
体外抗雌激素效应测定结果，本研究设4 个采样点，REF 雌激素当量值TEQ(E2 equivalents)0.8 ng/L，A 采样点值最高，为138.54 ng/L，B 点为27.61 ng/L，C 点为31.77 ng/L，造纸废水暴露位点的TEQ 值均比对照位点的高。
2.3 雄激素当量浓度DEQ
体外雄激素效应测定结果，REF 和4个采样点的雄激素当量值DEQ(E2 equivalents)分别如下，REF 采样点为0.21 ng/L，A 为6.52 ng/L，B 点为3.92 ng/L，C 点为4.21 ng/L，造纸废水暴露位点的DEQ 值均比对照位点高。
3 讨论
3.1 体外雌激素活性
研究表明，受造纸废水污染位点的体外雌激素活性均比对照位点的高，对照点雌激素当量值EEQ 为3.68 ng/L，造纸废水暴露位点中A 点值最高，为20.03ng/L。本结果显示，邓村竹浆造纸废水具有明显的体外雌激素效应。研究者推测造纸废水中的雄激素物质通过细菌的作用，代谢转化为雌激素物质，而产生了雌激素效应。野外调查和室内暴露的研究也同时表明，造纸废水具有这种效应。但也有研究表明，造纸废水不能诱导虹鳟鱼的幼鱼产生VTG，显示其不具备雌激素活性。关于造纸废水究竟是否具备雌激素效应的研究报道各不相同，结果与造纸的工艺流程、所处的实际环境密切相关，其中的机理仍需要进一步的研究阐明。
重组基因酵母筛选法是目前较为广泛应用的内分泌干扰物筛选法之一。然而，与受体结合仅是内分泌干扰作用的多个模式中的一种途径。很多活体生物试验虽然证实有类雌激素性质的化合物，酵母菌筛选实验却显示出阴性的结果。研究发现，除了经典的受体结合途径外，还可能存在着引起类雌激素活性的其它的快速信号转导途。另一方面，重组基因酵母法虽然灵敏、简单、快速，但是不可能完全代表生物体内完整的代谢变化。化合物由于有不同的膜传输方式，并且胞膜结构也不同，因此可能会影响到化合物进入酵母细胞与雌激素受体的结合。
3.2 体外抗雌激素活性
体外抗雌激素效应测定结果表明，对照位点REF他莫昔芬当量值TEQ 为0.8 ng/L，A 点值最高，为138.54 ng/L，B 点为27.61 ng/L，C 点为31.77 ng/L。赵建亮等[13]对珠江各河段的水样及其沉积物进行抗雌激素当量测试时发现，石井河的大部分样品在地表水中和沉积物中具有明显的抗雌激素效应，当量达到了浓度分别达到(80569.4)g/L TEQ 和(82.83.7)g/g TEQ。而本研究中，与对照点相比，造纸废水各采样点的抗雌激素效应比较明显。Orrego 等在造纸废水中检测到脱氢松香酸(Dehydroabietic acid ，DHAA)和-谷甾醇(-sitosterol，BS) 2 种化合物，用2 种化合物对鱼类进行暴露实验发现，DHAA 能抑制鱼VTG的生成，显示具有抗雌激素效应。有可能DHAA 与雌激素共同竞争雌激素受体从而抑制的VTG 的产生。造纸废水中的DHAA 对鱼类产生抗雌激素效应可能通过直接损伤肝组织的途径。因此，有人推测造纸废水中的DHAA 可产生细胞毒素病直接损伤肝脏，从而表现出抗雌激素效应。此外，EROD 活性的升高与抗雌素效应密切相关，造纸废水中有可能存在大量抗雌激素活性的小分子化合物，在诱导食蚊鱼体内EROD 活性升高的同时，抑制E2 的浓度，显示抗雌激素。
3.3 体外雄激素活性
研究表明，受造纸废水污染的各位点雄激素活性均比对照点高，其中，A 点DEQ 值最高。有研究者运用体外酵母实验对多种造纸废水进行了检测，研究结果发现这些造纸废水同时具有强烈的雄激素和抗-雄激素效应，虽然效应的强弱程度不是很一致。产生的效应与造纸水的成分、酵母的种类、转导培养的时间等参数密切相关。Shamba Chatterjee 等用改进了的体外酵母实验发现，造纸废水具有体外的雄激素效应和抗雄激素效应。但也有研究表明造纸废水不存在这种效应。最直接证据是世界多处在造纸废水排放口中发现了雄性化的食蚊鱼，揭示造纸废水中可能存在着雄激素物质。造纸废水中可能存在着大量与睾酮(testosterone)结构相似的物质，在体外实验中与AR 结合，引起了AR 的表达。Jenkins 等检测到造纸废水中含有雄烯二酮和反式雄烯二酮(androstadienedione，ADD)这2 类物质，怀疑是它们诱导了食蚊鱼雄性化。因此，利用YAS 快速检测水样中雄激素当量的方法虽然快速简单，但是当水样综合毒性太大的时候最好的办法就是先将水样进行分馏，以不同的馏分测试雄激素效应和雌激素效应可以有效地避免太大的误差。此外，如前所述，已知具有内分泌干扰效应的化合物中，也表明存在其它影响内分泌干扰效应的因素，并不是通过和雌激素受体结合而产生效应，如通过干扰激素受体形成来降低激素受体复合物的浓度水。所以，造纸废水对鱼类内分泌系统造成的干扰效应可能还存在着其他的途径。
4 结论
采用重组基因酵母法对受造纸废水污染的广东四会市邓村河水体的雌激素、抗雌激素和雄激素活性效应进行检测, 结果表明造纸废水污染的广东四会市邓村河水体均有雌激素、抗雌激素和雄激素活性效应,造纸废水的排放可能对当地环境造成了内分泌干扰物质的污染。因此，对造纸废水中的化合物进行定量定性分析，以及研究这些化合物的相互关系和代谢途径，是今后工作的重点所在。
