8-羟基喹啉对草鱼急性毒性和遗传毒性的研究
工农业产品中残留的农药成分因其难降解http://wwW.LWlm.cOM等特点最终会通过环境和食物链传递到人、畜，从而影响到人们的健康，其中以８－羟基喹啉（Ｃ９Ｈ７ＮＯ）较为普遍。８－羟基喹啉为白色或淡黄色晶体或结晶粉末，因其可与大多数金属离子发生络合反应，故被广泛应用于食品工业、石油工业和药物加工业等众多工业生产领域。但是，８－羟基喹啉及其衍生物具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用，对环境和人体健康会产生潜在的危害。已有报道，８－羟基喹啉对水生生物（如小球藻、鱼虱等）、植物（如蚕豆）、动物（如小白鼠）等均具有一定的诱变作用［１］，但有关８－羟基喹啉对草鱼的毒害作用尚未见报道。微核（Ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｕｓ）也叫卫星核，是真核类生物细胞中染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式，其形成原因是细胞的染色体发生断裂后进入下一次分裂时，丧失着丝粒的染色体片段（或行动滞后的整条染色体）不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞浆中形成游离于主核之外的微核。微核的染色与主核相同，在细胞间期呈圆形或椭圆形，其直径小于主核的１／３［２，３］。各种理化因子，如辐射、化学药剂等作用分裂细胞往往可产生微核。微核试验是在２０世纪７０年代由Ｈｅｄｄｌｅ和Ｓｃｈｍｉｄ分别独自创建，是检测细胞遗传损伤的一个非常有用的指标和检测化学物质毒性的一种常规方法，目前已广泛地用于测定和评价水体污染物对水生生物的遗传损伤和毒理效应［４，５］。
鱼类作为监测水体污染的一种合理的指示生物，近年来受到科学工作者的极大关注。已有研究发现，在鱼体内存在着与高等动物解毒系统类似的两阶段解毒系统。相比之下，鱼类的第一阶段解毒系统酶活力高，可以活化致癌原，但是第二阶段解毒系统酶活力低，活化的致癌原不易从体内排出。鱼类对致癌物比哺乳动物更为敏感，致癌物对鱼类的作用模式与哺乳动物具有可比性，研究结果可以外推到哺乳动物，因此，鱼类是理想的致畸变研究材料［６］。草鱼（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，因其抗污染能力强、易饲养、体型适中、便于操作、经济实用，是理想的水生生物实验材料［７］。本研究以草鱼为实验材料，研究８－羟基喹啉对草鱼的急性毒性和遗传毒性效应，旨在为指示和评价８－羟基喹啉对水生生物的毒害作用提供一定的理论参考，并为８－羟基喹啉安全指标的制定及其合理使用提供依据。 １ 材料与方法 １．１ 实验材料 草鱼１５０尾，购自新乡市花卉交易市场，发育状况相似，体长５～７ ｃｍ，健康状况良好。８－羟基喹啉（Ｃ９Ｈ７ＮＯ）购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯。 １．２ 实验方法 １．２．１ 急性毒性实验 首先进行草鱼的急性毒性预实验，根据预实验中各时间点的全致死浓度、全存活浓度的结果以及半数致死浓度（ＬＣ５０）的实验要求，将实验分为４个处理组和１个空白对照组（ＣＫ），每组１０尾草鱼，分别在室内５个９０ ｃｍ×６０ ｃｍ×４０ ｃｍ的玻璃缸中进行。处理组８－羟基喹啉浓度依次为２０、２５、３０、３５ ｍｇ／Ｌ，空白对照组不加８－羟基喹啉，用曝气自来水进行实验。先用蒸馏水将８－羟基喹啉配制成母液，实验前用曝气自来水稀释成各个处理组的浓度，每个玻璃缸中加入相应处理液４ Ｌ，每２４ ｈ更换１次等体积等浓度的８－羟基喹啉溶液，空白对照组每２４ ｈ更换１次等体积的曝气自来水。实验期间不投饵，仅用简易增氧机进行增氧，以草鱼呼吸停止及对外界刺激无反应作为死亡的判断依据，记录实验第６、１２、２４、４８、９６ ｈ内各组实验鱼的死亡情况，并及时剔除死亡个体。采用改进寇氏法（Ｋａｒｂｅｒ）计算８－羟基喹啉对草鱼的ＬＣ５０和安全浓度［８］。 １．２．２ 遗传毒性实验 在急性毒性实验的基础上，设置４个处理组和１个空白对照组，每组１５尾草鱼。处理组８－羟基喹啉浓度依次为１．１６２ ２、２．３２４ ４、３．４８６ ６、４．６４８ ８ ｍｇ／Ｌ，空白对照组（ＣＫ）不加８－羟基喹啉，用曝气自来水进行实验。遗传毒性实验条件和处理过程同急性毒性实验。分别于实验的第２、４、６ 天各取材１次，每次每个浓度组随机取２尾草鱼，断尾采血制作血涂片，荧光显微镜下观察并计数、拍照。每张血涂片随机观察１ ０００个红细胞，并统计带有微核的细胞数，计算微核率。微核细胞率＝带有微核的细胞数／观察的细胞总数×１ ０００‰。 １．３ 数据处理 实验数据用ｕ检验进行统计学分析，结果用平均数±标准差（x±ｓ）表示，Ｐ＜０．０５为差异显著，Ｐ＜０．０１为差异极显著。 ２ 结果与分析 ２．１ ８－羟基喹啉对草鱼的急性毒性 刚染毒时草鱼在水中急剧游动、四处乱窜、迅速翻腾，数分钟后逐渐缓慢趋于正常游动。其中，高浓度组的草鱼数小时后即表现出一定的中毒症状：即反应迟钝、身体逐渐失去平衡、翻肚，直至死亡，死亡个体身体呈弯弓形。以上现象说明８－羟基喹啉对草鱼具有较强的急性毒性，其２４、４８、９６ ｈ的ＬＣ５０分别为３２．３０、２６．９３、２０．９５ ｍｇ／Ｌ，安全浓度为１１．６２ ｍｇ／Ｌ；并且同一浓度组当处理时间延长时，其死亡率随之升高，具有明显的时间效应；在同一时间段内，当处理浓度增加时，其死亡率也随之升高，具有明显的剂量效应（表１和图１）。 ２．２ ８－羟基喹啉对草鱼的遗传毒性 ８－羟基喹啉诱导草鱼红细胞的微核如图２所示，微核率的观察结果见表２。对表２中的微核率数据进行统计学分析，发现在实验的第２、４、６天各处理组与空白对照组相比，红细胞微核率均达显著或极显著差异水平，最高浓度组（４．６４８ ８ ｍｇ／Ｌ）的微核率均为最大，微核率分别为２．０３８‰、７．７６３‰、１０．５０２‰，分别是空白对照组的６．１６、２４．０３、２７．４２倍。可见，随处理浓度的增加以及处理时间的延长，８－羟基喹啉能诱发草鱼的红细胞微核率增加，微核率与处理浓度和处理时间均呈正相关。 ３ 讨论 ８－羟基喹啉具有两性，可与大多数金属离子发生络合反应，故其广泛地应用于金属的测定与分离、生产喹碘方和氯碘喹啉等医药中间体，也是染料和低毒高效农药的中间体，其硫酸盐及铜盐络合物是优良的防腐剂、消毒剂和防霉剂、化学分析的络合滴定指示剂及某些医药原药的主要原料［９］。但是研究表明，８－羟基喹啉及其衍生物都具有潜在的致癌、致畸、致突变作用。目前，有关８－羟基喹啉对水生生物的诱变作用已有报道［１０］，然而，对于８－羟基喹啉的安全指标及其对水生生物的毒害作用还未得到进一步的研究。 本实验选用草鱼为受试材料，８－羟基喹啉为受试物质，分析８－羟基喹啉对草鱼的急性毒性和遗传毒性的影响，探究了８－羟基喹啉对水生生物的毒性大小及其相关的一些安全指标。其中，急性毒性实验中８－羟基喹啉溶液对草鱼的２４、４８、９６ ｈ的ＬＣ５０分别为３２．３０、２６．９３、２０．９５ ｍｇ／Ｌ，安全浓http://wwW.LWlm.cOM度为１１．６２ ｍｇ／Ｌ，表现出一定的急性毒性作用，并具有明显的时间效应和剂量效应；而遗传毒性实验表明，８－羟基喹啉能诱发草鱼红细胞微核的发生，并表现出明显的剂量效应和时间效应。本研究再次证明，微核的发生需要一定的条件，有害物质浓度在合理的范围内时，对细胞的影响较小，不会干扰其分裂能力；当有害物质浓度过高时，会影响细胞的正常分裂活动，从而导致红细胞微核率的增加，故随处理时间和处理浓度的增加，微核率增加，并有明显的剂量效应和时间效应。 本研究结果表明，８－羟基喹啉对草鱼有较强的毒性作用，而日常生活中８－羟基喹啉的使用剂量一般远远大于实验用剂量，因此，在日常生活中使用８－羟基喹啉时一定要注意安全，避免污染水源和破坏环境，从而对水生生物、家畜以及人类造成危害。