参七抗癌散[医院制剂批号:(98)A11-021]源于武汉科德中医医院张德忠老中医祖传秘方,2002年获武汉市科技进步三等奖,并获发明专利1项(专利号:ZL 02117062.2)。本方由西洋参、三七、半枝莲、南柴胡、白花蛇舌草、夏枯草、甘草、当归、白芍、枳壳组成,具有益气活血、软坚散结、解毒止痛之功效。张德忠院长使用其祖传秘方临床用于治疗肿瘤疾患40余年,治疗肿瘤患者数千例,大多为肺癌患者,能改善患者症状,控制肿瘤发展,减轻病人痛苦,提高生存质量,具有较好的疗效,受到广大患者欢迎。在临床疗效的基础上,武汉市科德中医医院与湖北中医药大学中药资源与中药化学省级重点实验室产学研结合,拟将该医院制剂研制成中药新品种。针对参七抗癌散的主治功效和临床疗效,本文对该制剂抗肿瘤活性和镇痛作用进行了药效学试验研究,取得了良好的试验效果,从而为其临床疗效提供了一定科学依据,也为将其开发中药新品种提供了参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试药物

参七抗癌散由武汉市科德中医医院提供。1.1.2 仪器 二氧化碳培养箱(Thermo Labsystems);酶标仪(Forma Series Ⅱ Water Jacketed);DLSB-5/20低温冷却循环泵(郑州长城科工贸有限公司);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);RE-3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);数显恒温水浴锅(常州奥华仪器有限公司)。

1.1.3 试剂

胎牛血清FBS(Gibco);RPMI 1640培养基(Hyclone),MTT (Sigma);5-氟尿嘧啶(5-Fu,Santa);胰蛋白酶;DMSO;盐酸吗啡注射液(东北制药集团沈阳第一制药有限公司,批号:120418-1);乙酰水杨酸(中国上海森灏精细化有限公司,99.5%-101.0%);冰乙酸(天津永大化学试剂有限公司);氯化钠注射液(开开援生制药股份有限公司,批号13100123);均为分析纯。

1.1.4 细胞

人非小细胞肺腺癌细胞株A549,由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。

1.1.5 动物

SPF级昆明小鼠,18-22g,由湖北省实验动物研究中心提供。实验动物使用许可证号:SCXK(鄂)2008-0005,置于湖北中医药大学标准动物中心饲养。

1.2 方法

1.2.1 供试药物制备

取一定量的参七抗癌散,倾出内容物,精密称取30g,加8倍量70%乙醇回流提取两次,每次1h,合并滤过溶液,回收乙醇至无醇味,加适量水稀释;首先用石油醚多次萃取,残留水液碱化后用氯仿多次萃取,残留水液酸化后再用乙酸乙酯多次萃取,残留水液继续用正丁醇多次萃取,剩下为残余水液;各萃取液分别减压回收溶剂,得石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶性物质;各提取物分别用DMSO溶解备用。

1.2.2 MTT法筛选

参七抗癌散有效部位取处于对数生长期,状态良好A549细胞制成单细胞悬液,接种至96孔培养板,以10%的FBS和1640培养液置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养12h,至细胞长至80%,分别加入参七抗癌散的供试品药液(浓度均为100g/ml),每个样品设6个复孔,然后再置37℃、5%二氧化碳培养箱继续培养24h,设空白对照组和阳性药物对照组(5-Fu,80g/ml)。药物作用时间完成后,弃去96孔板中细胞培养液,分别向96孔板中加入5mg/ml MTT溶液,每孔10l,置入培养箱中孵育4h。最后加入100l/孔的DMSO溶液终止反应,用酶标仪在570nm测OD值,实验重复3次,用SPSS 19.0软件处理实验数据,ANOVA法进行统计学分析,结果以珔xs表示。按以下公式计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率=[1-(实验组OD值-空白对照OD值)/(细胞对照OD值-空白对照OD值)]100%。

1.2.3 MTT法测定

参七抗癌散提取物氯仿部位不同浓度抗肿瘤作用 按上述同样方法将A549细胞接种至96孔培养板培养,分别加入参七抗癌散氯仿萃取物不同浓度的供试药物,每个浓度设6个复孔,设4个浓度梯度,加入细胞培养板后的终质量浓度分别为70,90,100,110g/ml,每孔100l。然后再置37℃、5%二氧化碳培养箱继续培养24h,空白对照组和阳性对照组设置同1.2.2。数据统计分析方法同1.2.2,结果以珔xs表示。

1.2.4 参七抗癌散对小鼠醋酸刺激致痛的影响

取体重18-22g SPF级小鼠50只,雌雄各半,随机分成5组:①生理盐水组:生理盐水0.1ml/10g;②阿司匹林组:100mg/kg;③参七抗癌散低剂量组:2.4g/kg;④参七抗癌散中剂量组:4.8g/kg;⑤参七抗癌散高剂量组:9.6g/kg。各组按10ml/kg灌胃给药1次/d,连续7d。末次给药30min后,各组小鼠按10ml/kg腹腔注射0.8%乙酸,记录注射乙酸后15min内各组小鼠出现的扭体反应动物数,并计算镇痛百分率。实验数据采用SPSS 19.0进行统计学分析,采用ANOVA分析法,结果用珔xs表示。

1.2.5 参七抗癌散对小鼠热刺激的影响选用18-22g雌性小鼠,放入(550.5)℃恒温水浴板上,测定其痛阈值(小鼠足部接触热板到开始舔后足的时间为痛阈值,以不超过30s为合格)。选择合格的小鼠50只,随机分5组:①生理盐水组:生理盐水0.1ml/10g;②盐酸吗啡组;100mg/kg;③参七抗癌散低剂量组:2.4g/kg;④参七抗癌散中剂量组:4.8g/kg;⑤参七抗癌散高剂量组:9.6g/kg。各组按0.2ml/10g灌胃给药,1次/d,连续7d。末次给药30min后,测定给药后15min、30min、60min、90min各鼠的痛阈值(如超过60s,则按60s计算)。

1.2.6 统计学分析

实验数据采用SPSS 19.0进行统计学分析,各组与其给药前采用t检验,给药后各组间重复测量采用ANOVA分析法,结果用珔xs表示,以P0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 有效物质部位的筛选

与空白对照组比较,参七抗癌散中颗粒醇提物和氯仿萃取物对A549细胞具有明显的抑制作用,且氯仿萃取物抑制作用极为显著(P0.01),其他萃取物质部位对肿瘤细胞抑制不明显,故可以推断该胶囊抗肿瘤有效物质主要集中于氯仿萃取物质部位。

2.2 不同浓度氯仿萃取物质部位抗肿瘤作用

可知与空白对照组比较,参七抗癌散氯仿萃取物对A549细胞抑制率较好且抑制率显著(P0.01),且随着浓度的升高而升高,呈剂量依赖性。

2.3 醋酸刺激扭体反应

实验结果表明,参七抗癌散能减少醋酸所致小鼠的扭体反应次数,与对照组(NS)比较,其高剂量组呈显著性差异(P0.05),提示参七抗癌散对乙酸所致小鼠的疼痛性反应有较好的对抗作用。

2.4 热板刺激反应

实验结果表明,与对照组(NS)比较,参七抗癌散能提高小鼠的痛阈值,其高剂量组具有显著性差异(P0.05),提示参七抗癌散对热刺激所致小鼠的疼痛性反应具有较好的对抗作用。

3 讨论

3.1 本论文对参七抗癌散抗肿瘤的有效物质部位进行了筛选研究。采用溶剂法与调节pH 值相结合的萃取方法,将该制剂提取分离为乙醇粗提物,石油醚萃取物质部位(脂溶性物质)、氯仿萃取物质部位(碱性物质)、乙酸乙酯萃取物质部位(酚酸性物质)、正丁醇萃取物质部位(苷类物质)和水溶性物质部位。抗肿瘤活性筛选结果表明氯仿萃取物质部位和乙醇粗提物对肺腺癌A549具有明显抑制作用,其他物质部位未呈现明显活性,从而确定为参七抗癌散抗肿瘤活性物质部位。进一步研究表明该有效物质部位对A549细胞的抑制率呈现剂量依赖性。因此,本项研究结果为参七抗癌散抗肿瘤作用的临床疗效提供了现代药理学实验依据。该制剂抗肿瘤有效物质部位化学成分的分离鉴定、活性筛选及作用机理正在研究中,以期诠释其抗肿瘤的药效物质基础。

3.2 据文献报道,肿瘤患者的剧烈疼痛与前列腺素E2和一氧化氮(NO)的高表达及其含量有关,前列腺素E2的含量与肿瘤大小、分期和有无转移相关。NO作为一种调节细胞多功能的信息分子,对外周及中枢神经痛觉机制中发挥重要作用。凤良元等报道了中药复方芍药甘草汤具有良好的镇痛作用,其镇痛作用机制与前列腺素E2和NO等化学物质有关。本论文研究表明,参七抗癌散具有明显的镇痛作用,该制剂处方中含有芍药和甘草(2∶1)药对,其镇痛机制推测由该药对能抑制前列腺素E2的合成和降低血细胞中NO的含量。

3.3 参七抗癌散制剂临床治疗肿瘤患者数千例,效果良好。本论文采用现代药理学方法对其抗肿瘤生物活性和镇痛作用进行了研究,取得了良好的预期效果,从而为该医院制剂的临床疗效提供了药效学实验依据,并为其开发中药新药品种奠定了一定基础。