[摘要] 目的 探讨RECK、MMP-14及VEGF在喉癌中的表达情况及临床意义。 方法 选择2013年8月～2015年1月辽宁省肿瘤医院选手术治疗的喉癌患者41例，分别取其喉癌组织和癌旁组织，另取喉息肉行手术切除患者的息肉组织作为对照。分别采用Realtime-PCR和Western blot检测各组织中RECK、MMP-14及VEGF mRNA和蛋白的表达情况，分析其与喉癌临床病理特征的相关性。 结果 MMP-14和VEGF在喉癌组织的表达明显高于癌旁组织及息肉组织（P
[关键词] 喉癌；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白酶-14；转移
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）01（b）-0085-04
[Abstract] Objective To investigate expression and clinical significance of RECK， MMP-14 and VEGF in laryngeal carcinoma. Methods From August 2013 to January 2015， in Tumor Hospital of Liaoning Province， 41 patients with laryngeal cancer and underwent surgical treatment were sel
ected， the throat cancer tissue and para-carcinoma tissue were collected respectively， at the same time， polypus tissue from 15 patients with laryngeal polypus were collected as control. Realtime-PCR and Western blot were used to detect the organisations of RECK， MMP-14 and VEGF mRNA and protein expression respectively， the correlation of they and clinical pathological features of laryngeal cancer was analyzed. Results The expression of MMP-14 and VEGF in laryngeal carcinoma was significantly higher than those in para-carcinoma tissue and polypus tissue （P
[Key words] Laryngeal； Vascular endothelial growth factor； Matrix metalloproteinase 14； Metastasis
喉癌源于喉上皮，是头颈部发病率第二高的恶性肿瘤，具有高度的侵入性和转移性，其发生发展涉及多种因素和多个步骤[1-2]。基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase 14，MMP-14）是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族的重要成员之一[3]，参与家族中其他MMPs的激活，起到降解和重塑细胞外基质的作用，同时在胃癌、乳腺癌和食管癌等众多癌症的侵袭转移中发挥重要作用[4-5]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生，在肿瘤转移及肿瘤再生中发挥重要作用[6]。RECK（reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK）基因是一种新型肿瘤转移抑制基因和MMPs抑制剂，已报道RECK对MMP-14和MMP-2等多种MMPs家族成员有抑制作用，该作用可以抑制肿瘤细胞的生长、发展及侵袭[7-8]。本研究通过采用Realtime-PCR和Western blot检测喉癌患者组织中RECK，MMP-14和VEGF mRNA和蛋白的表达情况，进一步分析其与喉癌临床病理特征的相关性，为喉癌的转移和预后的判断提供一定的实验依据，为其机制研究奠定基础。 1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2013年8月～2015年1月于辽宁省肿瘤医院手术治疗的喉癌患者41例，其中男29例，女12例，年龄45～81岁，患者术前均无放疗、化疗及其他免疫治疗经历，签署知情同意书，在术中分别取喉癌组织和癌旁组织；此外，在此期间选取15例喉息肉行手术切除患者的息肉组织作为对照，分别将上述组织置液氮中保存。
1.2 主要试剂与仪器
RECK、MMP-14、VEGF引物由北京华大基因公司合成；荧光定量PCR试剂盒为TAKARA公司产品；RECK、MMP-14、VEGF抗体为北京博奥森生物技术有限公司产品；ABI 7500 Real-Time PCR仪为美国ABI公司产品；垂直板电泳、转膜仪、凝胶成像系统为美国BIO-RID公司产品。
1.3 方法
1.3.1 RECK，MMP-14 and VEGF mRNA检测 根据GenBank中报道的RECK、MMP-14、VEGF基因序列，应用DNASTAR软件设计引物（表1）；液氮罐中取出保存的组织样本，约100 mg加入1 mL Trizol，迅速研磨成匀浆液，采用Trizol法提取RNA，反转录至cDNA，用Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒配伍反应体系（R.T.product 1 μL、SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL、Primer 1 1 μL、Primer 2 1 μL、H2O 7 μL），放置荧光定量PCR仪中，设置PCR热循环参数：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s收集荧光信号，40个循环。
1.3.2 RECK、MMP-14、VEGF蛋白检测 采用Western blot法检测各组织样本RECK，MMP-14 和VEGF表达水平。从液氮中取组织样本，称取100 mg，加1 mL RIPA和10 μL PMSF混合液，研磨制成乳悬液，12 000 r/min离心10 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度，加上样缓冲液，沸水煮5 min后行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭，分别加兔抗人RECK，MMP-14和VEGF抗体，4℃孵育过夜，洗膜后加HRP标记羊抗兔IgG二抗，室温下孵育1 h；TBST洗膜3次，15 min/次；ECL发光法试剂盒显色。
1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P
2 结果
2.1 RECK、MMP-14、VEGF mRNA检测
RECK、MMP-14及VEGF mRNA检测结果见图1，RECK基因在喉癌组织中的表达量低于喉息肉组织和癌旁组织（P
2.2 RECK、MMP-14、VEGF蛋白检测
Western blot检测结果见图2，RECK蛋白在喉癌组织中的表达量低于喉息肉组织和癌旁组织（P
0.05）。
2.3 RECK、MMP-14及VEGF蛋白表达与临床参数的关系
分析喉癌组织中RECK、MMP-14及VEGF蛋白在不同年龄、性别、病理分级、淋巴转移及临床分期中的表达量具体见表2，RECK、MMP-14和VEGF的蛋白表达与病理分级、淋巴转移及临床分期有关（P
0.05）。
2.4相关性分析
RECK与VEGF mRNA在喉癌组织中的表达呈负相关（r = -0.907，P = 0.013）；RECK与MMP-14 mRNA在喉癌组织中的表达呈负相关（r=-0.812，P = 0.027）；VEGF与MMP-14 mRNA在喉癌组织中的表达量有显著的线性相关性，其相关系数为0.698，线性方程为Y = 0.00561+0965X（图3）。
3 讨论
细胞外基质是癌细胞在转移及微转移过程中面临的第一道屏障，MMPs在细胞外基质降解过程中发挥重要作用，与肿瘤侵袭转移机制相关，是近年来研究较多的酶类。 MMP-14位于细胞表面，属于MMPs家族中的一种特殊酶类，可降解细胞外基质蛋白。研究表明，MMP-14能够以可溶形式分泌在细胞外，降解肿瘤细胞外基质和基底膜，可通过MMP-2的激活，阻挡肿瘤细胞的浸润[9-10]。MMP-14的表达与VEGF的表达呈正相关，可以促进血管再生，在肿瘤血管生成过程发挥重要作用[11]。Chaffe等[12]用Realtime-PCR在膀胱癌中检测出MMP-14 mRNA的高表达，其表达量与肿瘤的浸润和淋巴结转移呈正相关。Wu等[13]将MMP-14转染SW626细胞系，结果癌细胞增值和侵袭能力得到抑制。本研究结果表明，MMP-14在喉癌组织中高表达，其表达量与与肿瘤的分期、淋巴结转移相关。综上推测MMP-14在肿瘤的侵袭中发挥重要作用，可促进肿瘤的生长，侵润和转移。
VEGF分裂能力较强，可以加速肿瘤细胞的增殖，促进新生肿瘤血管的形成，增加了血管通透性，为肿瘤转移创造了条件，是肿瘤形成的必要途径。研究表明，VEGF在胆管癌、大肠癌、卵巢癌、大肠癌、胃癌和口腔鳞状细胞癌等组织中表达量明显高于癌旁组织[14-17]。在本研究中，喉癌组织中VEGF的表达亦高于癌旁组织，且其表达量与病理分级、淋巴转移、临床分期有关，提示VEGF蛋白可在喉癌诊断及治疗方案中发挥作用，其具备评估喉癌侵袭转移的潜能。 RECK基因是MMPs的抑制剂，可有效抑制MMP-2，MMP-4和MMP-14等MMPs家族成员的表达，在抑制肿瘤侵袭中发挥重要作用[18-20]。Kumamot等[21]研究结果表明，RECK基因的表达与肿瘤分级呈负相关，其肿瘤的恶性程度越高，RECK的表达量越低。本研究中癌旁组织和喉息肉组织中RECK mRNA和蛋白的表达量均明显高于癌组织（P
综上所述，喉癌组织中MMP-14和VEGF mRNA和蛋白的表达量升高，RECK基因的表达量降低，联合检测MMP-14、VEGF和RECK基因对喉癌的诊断、临床分期的判断、喉癌侵袭具有重要意义，可作为判断喉癌生物学行为的重要参考指标；此外，这3种基因的同时检测并进一步深入研究，将有助于找到治疗喉癌浸润转移的有效靶点，为开发抗肿瘤药物和分子靶向治疗提供新选择。
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