摘要：以乙醇、去离子水为提取剂，采用分光光度法和紫外光解法测定不同量的野木瓜（Stauntonia chinensis）醇提物和水提物对亚硝酸盐的清除和亚硝胺的阻断作用。结果表明，加入4.0 mL提取液（相当于从0.8 g的野木瓜粉中提取的量），醇提物和水提物对亚硝酸盐的清除率分别为86.84%和75.88%，对亚硝胺合成阻断率可达92.91%和87.50%，说明野木瓜有良好的抗癌作用，且其醇提物优于水提物。
关键词：野木瓜（Stauntonia chinensis）；亚硝酸钠；清除；亚硝胺；阻断
中图分类号：R730.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5504-03
N-亚硝基化合物是一类强烈的化学致癌物质，它们能诱发许多动物的多种器官组织恶性肿瘤[1]，它主要是通过诱发DNA互补碱基对之间的交联而启动细胞的癌变[2]，至今尚未发现一种动物对N-亚硝基化合物的致癌作用有抵抗力[3]。正常情况下人们直接从食物中摄入的亚硝胺的量微乎其微，但其前身仲胺和亚硝酸盐却广泛存在于食物和水体中。仲胺广泛存在于鱼类、谷类、茶、烟叶等食品饮品中，食物烹调和体内代谢也可能产生仲胺，而亚硝酸盐则更广泛地存在于土壤、水体和食物中[1]，亚硝胺很容易由仲胺和亚硝酸盐反应合成[1]，在人体胃液的环境下尤为容易。因此，清除亚硝酸盐或阻断亚硝胺的合成，是防癌抗癌的有效途径。众多学者研究证实黄酮类化合物对清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成有显著作用[4-6]，另外，酚类、还原糖和多糖类、维生素类、氧化还原酶类等物质也有一定的清除和阻断作用[7]。
野木瓜（Stauntonia chinensis）是木通科野木瓜属植物。贵州省正安县于1996被国务院发展研究中心等单位命名为“中国野木瓜之乡”，其盛产的野木瓜以果大、 皮薄、 肉细、 气香、 味甘酸等特点著称[8]。中医典籍记载其茎叶微苦，其果味甘、平，归心、肾经[9]，具有舒筋活络、解渴生津、平肝和胃、祛风止痛等功效。现代研究表明，野木瓜中含有丰富的皂苷，主要包括去甲五环三萜皂苷类化合物和木脂素苷类化合物，还含有黄酮苷类化合物、酚性成分、糖类化合物[10]，此外，野木瓜果实中含有丰富的有机酸、果胶、胡萝卜素、黄酮类、氨基酸、多种维生素和多种矿物质等[11]，这些物质对清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成均有一定的作用。国内外对野木瓜的镇痛抗炎、放射增敏及肝保护等方面的研究较多[12，13]，但对野木瓜提取物清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成能力的研究却很少。显然，在人们日益关注自身保健的今天，若能发现野木瓜有清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的功效，将对开发其在保健、防癌抗癌方面的新用途具有积极的意义。本试验在体外模拟人体胃液的条件下，研究野木瓜对亚硝酸盐的清除和亚硝胺合成的阻断作用，以期为野木瓜资源的进一步开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 野木瓜，购自贵州正安县。试剂：石油醚、无水乙醇、碳酸钠、33%（质量分数）二甲胺均为化学纯，α-萘胺、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺盐酸盐均为分析纯，pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（配置方法见文献[14]），试验用水均为去离子水。
1.1.2 仪器 752N型紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司），SHZ-DⅢ型予华牌循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），BSA223型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），ZF-20D型暗箱式紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂），DK-S26 型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司），PHS-2F型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）。
1.2 方法
1.2.1 样品预处理 将野木瓜鲜果洗净→去子囊切成2～5 mm薄片→50 ℃烘干→粉碎后过40目筛→石油醚脱色回流至石油醚无色→抽滤，滤渣风干。
1）准确称取处理后的野木瓜粉5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加入83%乙醇151 mL，在70 ℃回流浸提2 h，抽滤，滤液在60 ℃减压浓缩，最后定容至25 mL，得野木瓜醇提物。
2）准确称取处理后的野木瓜粉5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加入去离子水151 mL，在70 ℃回流浸提2 h，抽滤，滤液在60 ℃减压浓缩，最后定容至25 mL，得野木瓜水提物。
1.2.2 对亚硝酸盐清除率的测定[15，16] 亚硝酸盐在弱酸性条件下，与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色络合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度，就可知道反应液中亚硝酸盐含量多少。根据这一原理比较不同试验条件下亚硝酸盐含量的多少来反映不同浓度野木瓜提取液清除亚硝酸盐能力的大小，亚硝酸盐含量少，野木瓜提取液清除能力就强，反之则弱。
准确吸取pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液10 mL于20 mL容量瓶中，分别加入“1.2.1”所得的野木瓜醇提物和水提物样液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL。再加入0.1 g/L的亚硝酸钠溶液2 mL，用去离子水定容至刻度，37 ℃恒温反应1 h取出，分别吸取反应液1 mL置于10 mL容量瓶中，加入0.4%的对氨基苯磺酸2 mL，摇匀，静置5 min，然后加入0.2%盐酸萘乙二胺2 mL。摇匀，静置15 min，在540 nm处测定吸光度，平行做3次求平均值。
清除率=（A0-Ax）/A0×100%
式中，A0为未加提取液（即加入0 mL提取液）时的吸光度；Ax为加入不同量提取液的吸光度。
1.2.3 对亚硝胺合成阻断率的测定[14] 在体外模拟人体胃液的条件下（pH 3.0，温度为37 ℃），二甲胺很容易与亚硝酸钠反应，合成二甲基亚硝胺，其化学反应方程式为： HCl
（CH3）2NH+NaNO2→（CH3）2N・N0+NaCl+H2O
当往野木瓜醇提物和水提物中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时，提取物优先同亚硝酸钠作用，从而达到阻止亚硝胺生成的目的。据此可以通过比较相同条件下生成亚硝胺量的多少来反映提取物阻断能力的强弱，生成亚硝胺量少，提取液的阻断能力就强，反之则弱[14]。
基于N-亚硝基化合物的光化学反应，在紫外光照射下，亚硝胺光解并转变成相应的仲胺和亚硝酸根，基反应式为：
紫外光
H2O+（CH3）2N・NO→（CH3）2NH2++NO2-
测定NO2-的含量（方法见“1.2.2”）即可知二甲基亚硝胺的含量，从而即可测出提取液对亚硝胺合成的阻断率。具体方法为：准确吸取“1.2.1”所得野木瓜醇提取物和水提物样液0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL于20 mL容量瓶中，分别加入pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液10 mL，再加入0.1 g/L的亚硝酸钠溶液2 mL， 加入1 mmol/L的二甲胺溶液1 mL， 用去离子水定容，37 ℃恒温反应1 h。准确吸取1 mL上述溶液到7 cm2培养皿中，加入0.5% Na2CO3溶液0.5 mL，在紫外分析仪上照射15 min（紫外灯距液面15 cm）。取出加入1%的对氨基苯磺酸和0.1%α-萘胺各1.5 mL，加入去离子水0.5 mL，混匀，静置15 min，在525 nm处测定吸光度，平行做3次求平均值。计算公式为：
阻断率=（A0-Ax）/A0×100%
式中，A0为未加提取液（即加入0 mL提取液）时的吸光度；Ax为加入不同量提取液的吸光度
2 结果与分析
2.1 野木瓜提取液对亚硝酸盐清除作用
野木瓜提取液对亚硝酸盐清除作用见图1。从图1可以看出，在体外模拟人体胃液的条件下，当加入提取液的量较少时，野木瓜提取液（醇提物和水提物）对亚硝酸盐的清除作用均较小，并随着提取液量的增加而缓慢增加，醇提物的清除作用略高于水提物，原因可能是尽管醇提物中黄酮含量高于水提物，但由于水提物中溶解了更多的糖类化合物和有机酸，这些物质对亚硝酸盐具有一定的清除作用，所以使二者的差距不大。当加入提取液的量由1.0 mL增加到2.0 mL时，对亚硝酸盐的清除作用迅速增加，超过2.0 mL后，增长放缓，醇提物对亚硝酸盐的清除作用明显高于水提物，并且差距越来越大，这可能是醇提物中含有更多的黄酮类化合物，对亚硝酸盐的清除作用更突显出来。当加入提取液4.0 mL，醇提物对亚硝酸盐的清除率可以达到86.84%（水提物为75.88%），说明野木瓜对亚硝酸盐有较好的清除作用。
2.2 野木瓜提取液对亚硝胺合成的阻断作用
野木瓜提取液对亚硝胺合成的阻断作用见图2。由图2可知，在体外模拟人体胃液的条件下，随着野木瓜提取液量的增加，对亚硝胺合成的阻断能力迅速提高，在0.5～1.0 mL时，野木瓜醇提物对亚硝胺的阻断率略低于水提物，可能是由于水提物中溶解了更多的糖类化合物和有机酸的原因。当加入提取液量超过1.0 mL后，醇提物对亚硝胺合成的阻断作用迅速增长，快于水提物，并慢慢超过水提物，这可能是由于醇提物中含有较多的黄酮类化合物，其对亚硝胺合成的阻断作用逐渐突显出来。当加入提取液量超过1.5 mL后，水提物对亚硝胺合成的阻断作用的增加逐渐放缓，而醇提物在超过1.5 mL后仍快速增加，直到2.0 mL后才放缓，并使其阻断率显著高于水提物。在加入提取液量超过3.0 mL时醇提物和水提物对亚硝胺合成的阻断作用的变化均趋于平缓。当加入提取液量4.0 mL（相当于0.8 g野木瓜粉的提取液）时，醇提物对亚硝胺合成的阻断率可达92.91%（水提物也可达87.50%），说明野木瓜对亚硝胺合成有很好的阻断作用。
3 结论
研究结果表明，在体外模拟人体胃液的条件下（pH 3.0，温度为37 ℃），用0.8 g野木瓜粉的乙醇提取液对亚硝酸盐的清除率可达86.84%，而水提取液为75.88%，乙醇提取液对亚硝胺合成阻断率可达92.91%，而水提取液为87.50%，说明野木瓜提取液对亚硝酸盐的清除和亚硝胺合成阻断均有明显的作用，其中，醇提物对亚硝酸盐的清除及对亚硝胺合成阻断作用均高于水提物。因此，野木瓜的抗癌开发利用前景可观，它可能成为一种经济有效的天然抗癌生物资源和抗癌保健食品或饮品。
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