摘要：防疫工作一直是实验动物安全管理的重要环节。根据医学与生命科学实验室特点以及清华大学实验动物中心的具体情况，采取6项有效措施，探索了实验动物生物安全管理模式，建立了安全、健康的实验环境，加强了实验动物安全管理体系，提升了实验动物专业技术服务水平和科研支撑能力，有效地保障了实验教学及科学研究的顺利开展。
关键词：实验动物；防疫工作；生物安全；安全管理
实验动物作为实验医学与生命科学研究的重要支撑条件[1]，在欧美、日本等世界发达国家都有着50年以上长足的发展，实验动物硬件条件和行业管理规范也已经非常完善，具备先进的微生物检测和控制水平，实验动物质量也越来越高，比如啮齿类动物都已普及到无特定病原体（specificpathogenfree，SPF）级[2]。我国从1988年国家科委发布《实验动物管理条例》以来，也逐渐建立了法制化、规范化与标准化的管理体制[3]。尤其是近10年来，实验动物在生命科学与医学研究中的重要作用越发凸显出来，与国外发达国家逐渐饱和并略有降低的实验动物使用量趋势不同的是，我国实验动物使用量成倍增长，高校与科研院所、医药企业都相继投入大量人力、物力、财力，建设了越来越多的大型实验动物设施，设施规模、硬件配备都已经与欧美等发达国家比肩。随着设施规模的扩大和数量的增多，实验动物从业人员也迅速增加，而实验动物的饲养方式，尤其是啮齿类实验动物，大多是以高度密集化的方式进行饲养和动物实验，如采用独立通气式笼具（inspanidualventilatedcages，IVC）使得单位空间饲养量比常规饲养方式提高了近两倍。在我国实验动物生产和使用的种类、数量迅速增加的同时，实验动物标准和质量也在逐渐提高[4]。实验动物生产供应专业化、规模化也迅速发展。但与之相应的实验动物微生物检测手段、检测水平以及实验动物微生物质量与西方发达国家还有一定距离，具体表现在啮齿类实验动物使用质量还一直停留在清洁级水平，SPF级供应量和使用量比例还很低，另外国家标准实验动物微生物和寄生虫检测病原种类和检测方法还存在一定差距[5]。可以说，我国大规模的繁育和使用实验动物给实验动物生物安全管理带来越来越多的风险和挑战。
1近年来实验动物生物安全问题的事故案例
实验动物生物安全是指对实验中使用的动物可能存在的风险与危害进行相应的防范和控制，其中存在的生物安全隐患包括繁育、运输、抓取、麻醉、采血等[6]。此外使用实验动物时，在风险评估中要充分考虑动物源性感染性微生物的伤害特征。有证据显示，实验动物还能通过唾液、尿液和粪便散布动物源性、感染性微生物和其他的感染性因子[7]。总之实验动物生物安全问题一直伴随着实验动物科学的发展，成为挥之不去的阴影。尤其是最近国际权威杂志《自然》对我国两家科研机构近百名的科研人员和研究生同时被发现感染了实验室源性布鲁氏细菌事件发表评述并提醒业界关注。2019年12月7日，中国农业科学院兰州兽医研究所确认96名教职员工和学生的布鲁氏菌感染呈阳性。随后12月10日黑龙江省卫健委官方网站也确认在哈尔滨兽医研究所的13名学生也感染了该布鲁氏菌，他们是曾经去兰州兽医研究所实习过的49名学生中的13名。《自然》还披露早在2011年东北农业大学28名学生和员工被教学用山羊布鲁氏菌感染的事件[8-9]。有关实验动物获得性病原感染事件在国内外引起的实验室生物安全事件在媒体和杂志上屡见报道。如何明忠等[10]2004年对实验室感染流行性出血热调查显示，20世纪末全国各地实验大鼠和工作人员进行流行性出血热感染检测的阳性率都非常高；2003年北京某实验室在实验操作过程中感染SARS病毒并引起一定范围内传染事件；2004年天津某医院收治9位来自同一实验室工作人员感染流行性出血热病例[11]；2006年长春某高校中药系实验室76名实验学生中发生10名感染流行性出血热事件[12]；2009年法国食品卫生安全署的科学家在实验室中对动物病体进行实验研究时，意外感染致命性炭疽病菌，受感染的5名人员被紧急隔离至医院监控以及治疗[13]；2011年，芝加哥大学实验室一研究员因实验动物而引发皮肤感染蜡状芽孢杆菌[14]。以上这些案例的发生表明实验动物生物安全管理工作必须引起高度重视。本文以清华大学为例，对高校实验动物生物安全管理模式进行了探究。
2清华大学在实验动物安全管理方面的实践经验
随着高校开展一流大学和一流学科（双一流）的建设，生命科学、医学和药学等方面的科学研究也得到了快速发展[15-16]，从而对实验动物相关的服务和管理提出了新的要求和挑战。我校实验动物中心（以下简称“动物中心”）作为学校15个校级平台之一，始建于2007年，是我校“十一五”期间重点建设的校级平台。我们在分析总结国内外各单位的先进经验的基础上，作出了适用于我国高校科学研究实验动物相关的探索和尝试。动物中心现有一期动物设施建筑面积2900m2，2009年9月正式投入使用，小鼠IVC笼位2万个、大鼠IVC笼位300个、家兔100笼位；二期动物设施建筑面积4700m2，2019年11月份投入使用，小鼠IVC笼位3.5万个。目前为校内18个院系、近300个独立实验室的实验动物研究项目提供技术服务保障。由于每天进出动物设施的工作人员和师生近600人次，因此做好实验动物生物安全防疫工作至关重要。动物中心运行10年来，在学校实验室管理处、生命科学学院、实验动物使用与管理委员会（InstitutionalAnimalCareandUseCommittee，IACUC）和北京市实验动物管理办公室的指导下，动物中心的生物安全防疫工作管理制度逐步得到完善和落实，形成了一套严密的防止动物疫情发生和对动物进行医护的管理制度。动物中心在实验动物安全管理方面主要实施了以下6项有效措施。
2.1严把“入口关”，是预防实验动物病原输入的关键环节
所有实验动物项目在开展前，必须经过IACUC的审阅和通过，赋予IACUC编号后才可以订购动物，确保后续的动物实验合理合法合规，得到稳定准确的实验结果，保障人员职业健康安全及实验动物福利。10年来，动物中心使用的实验动物种类较少，主要是实验小鼠、大鼠、兔和豚鼠，其中小鼠占实验动物使用量的95%以上，大鼠约占4%，其余为实验兔和豚鼠。针对动物中心实验动物来源及实验目的，可以将实验动物分为做短期实验和需要长期繁育保种实验两大类。由于使用者对实验动物的微生物和寄生虫的质量及遗传质量缺乏了解，对于做短期实验的实验动物，动物中心统一进行订购和健康检查。具体订购实验动物的原则是根据北京市实验动物管理办公室每半年公示的《实验动物生产动物质量抽检结果》和供应商的规模和行业口碑，遴选优质的合格实验动物供应商。在此基础上，动物中心进一步要求候选供应商按时提交最新季度抽检动物健康检测报告。动物购入后，实验小鼠、大鼠、兔和豚鼠需要经过具有一定资质的饲养管理人员和兽医仔细观察和记录动物的精神状态，然后适应性饲养至少3天，确保无异常情况发生后再开展动物实验研究。对于引入需要长期保种繁育的实验动物（如遗传工程小鼠），首先要求引入机构提供至少最近3个月的哨兵鼠微生物和寄生虫检测质量报告。在这方面国外发达国家来源小鼠的机构一般都会给出供应动物所在设施、所在房间和所在笼架哨兵鼠至少最近3年的微生物和寄生虫质量检测情况，期间出现的微生物和寄生虫感染情况都会列出，并提供设施的防疫管理程序。国外的检测病原种类也比国内标准所要求的多。目前国内大部分机构对实验动物设施缺乏这方面的报告，一般只给出设施中几只小鼠送检微生物和寄生虫质量检测结果，缺乏供应小鼠所在房间及笼架哨兵鼠的检测结果，因此很难确定提供动物的真实健康状况。对于外来需要长期繁育保种的小鼠，进入动物中心后将安排生物净化，去除不符合国家SPF级要求的病原小鼠。动物中心设有基因工程小鼠繁育保种房间，所有动物中心以外来源的动物都必须经过胚胎移植或体外受精–胚胎移植的方式进行生物净化后才能进入。动物中心为保障生物净化受体用小鼠的质量，专门引进SPF级B6小鼠进行繁育，以此满足实验室对野生型B6小鼠的需求，避免外来动物带来防疫的风险。10年来，小鼠微生物和寄生虫检测结果显示，动物中心繁育供应的B6小鼠微生物和遗传质量达到世界一流水平。此外，生物材料在实验动物模型制作方面的广泛应用也为实验动物防疫安全提出挑战。所以，在生物安全管理上要把控好各种来源的生物材料安全性检测，防止存在人源或动物源传染疾病病原在实验动物上使用。现在人源化动物模型的制作和使用越来越受到更多研究者的关注。由于临床来源的人肿瘤组织是生物材料中风险最大的，动物中心要求研究者要确认病人无传染性疾病。其次是针对各种来源的可传代的肿瘤细胞，动物中心要求提供检测证明，排除支原体等病原。实验动物研究项目在递交申请时，涉及有害物质时要求详细填写危害和风险评估，以及出现污染后的应急处理方案等，为以后在项目执行阶段提供依据。
2.2严把“出口关”，是实验动物生物安全和保障动物福利条件的需要
实验动物尤其是啮齿类实验大鼠、小鼠从免疫学讲都是免疫相对缺陷的，原因是实验大鼠、小鼠从出生到安乐死都一直饲养在洁净的屏障环境，没有机会接触到人兽共患病病原和动物烈性传染性病原，也不对这些病原进行免疫。实验室动物测试区若得不到有效的防护，很容易被环境和人的病原感染，形成病原的放大效应。研究者若需把实验大鼠、小鼠移至屏障环境以外的实验室的仪器设备中进行测试，必须通过IACUC的审查。同时，IACUC要求实验室动物测试区有防止野生动物进入或实验动物逃逸的措施，如门口设置挡鼠板，房间布置捕鼠笼、粘鼠板等。IACUC会授权动物中心兽医定期和不定期对实验室测试动物区域进行生物安全巡检，发现问题及时解决。测试后的实验大鼠、小鼠不能再返回屏障设施，只能放置在屏障外区单独设置的设施IVC内，以免动物因屏障外区不确定因素和测试材料给屏障环境带来风险。在一期和二期建设中，动物中心都设置了屏障外实验室测试实验小鼠返回的洁净饲养空间，可以短期内继续进行实验观察，空间内设置独立的送排风和独立的通气笼具饲养，这样的设置把潜在的风险排除在屏障环境之外，避免其他屏障内动物受到影响。
2.3严把“屏障关”，保障实验动物微生物质量的基本要求
饲养在屏障环境的实验大鼠、小鼠对环境质量要求较高，因此对屏障环境的人流、物流、动物流、空气流从硬件设计上要满足各行其道、避免交叉。若硬件和空间不能满足，需要从软件管理等方面在时间上避免交叉操作。动物中心人员进出频繁，每天进出屏障环境的工作人员和实验人员近600人次，而人员又是屏障环境防疫安全较难控制的危险源。屏障入口设置门禁是动物设施常规配置，动物中心还对所有屏障环境的房间设置门禁。对申请进入动物中心开展动物实验的人员和新入职的工作人员，要先通过培训考核取得实验动物从业人员岗位证书，再集中进行屏障设施使用前的培训，并由专业人员讲解和演示口罩、头罩、手套等个人防护用品的穿戴顺序，人员、物品、动物的流向，动物饲养笼使用以及实验操作注意事项等。在开展动物实验之前还要对实验者进行动物实验基本技能的培训，包括动物如何抓取固定等基本操作，以减少后续在独立操作中被动物咬伤的几率。另外，对无菌手术操作也需要进行培训和技术指导。兽医在屏障设施内巡查工作，对实验者在后期的动物实验操作中出现的问题会进行及时纠错，以保证将人员危险因素降低到最小。实验人员所携带的动物实验材料也是“屏障关”较难控制的方面，实验材料进入屏障主要通道是传递窗。传递窗紫外线杀菌的有效率比较低，紫外线照射时间一般要求15min以上才能达到杀菌效果。而实验人员有时会因为等待时间太长而强行开门取出物料。为根除隐患，动物中心将传递窗全部更换通量更高的氙光灯，将照射时间缩短到3min，测试杀菌效果可达到93%以上。对常用的实验材料（如注射器、离心管、棉签等）高压灭菌后免费供应实验人员使用。对于难以消毒灭菌的实验记录本禁止传入，在屏障内配置联网计算机和打印机，实验者可以下载实验数据表打印，记录数据后存入计算机，纸张带回实验室保存。其他常规循环使用的笼具、清洁用品等要使用脉动高压灭菌锅121℃，20min灭菌后使用。动物饮水采用反渗透膜过滤、紫外照射杀菌和定时臭氧消毒的方式保持无菌状态，使用自动灌瓶机减少人为带来的污染，达到抑制水中细菌和真菌滋生的目的。罐装水瓶存放有效时间不超过7天。动物中心在二期动物设施采用自动饮水系统，完全封闭且达到无菌状态，对动物质量起到更好的支撑作用。除严把动物“入口关”外，对屏障内的动物根据防疫级别分级控制，比如动物中心繁育小鼠的房间设置为最高微生物控制级别，其次是动物中心代管的基因工程小鼠房间，再次是实验人员自己繁育保种的基因工程小鼠房间，再低的是从繁育房间取出的小鼠进行测试实验的房间，从供应商来源的小鼠测试房间或从其他机构来源的小鼠防疫级别设置最低。人员流向、动物流向、物料流向都要严格按照从高到低，绝对禁止逆向流动，若再进入防疫更高级别的房间要隔离至少24h。
2.4严把“监测关”，监测实验动物微生物和寄生虫状况，为稳定实验结果提供保障
实验动物微生物和寄生虫质量的影响因素非常复杂，不同的病原传播途径也不尽相同，因此要定期对屏障环境控制的效果进行评价。在饲养笼架设置垫料接触型哨兵鼠，定期对哨兵鼠进行检测是啮齿类动物生产和使用设施常规采用的病原检测方式。动物中心对小鼠微生物检测的病原种类比国家SPF级标准要求的更多，与国际一流实验室的检测项目基本一致，目的是保障我校的实验动物质量达到国际一流水平，为高水平科学研究提供保障，为实验结果的稳定性和一致性提供坚实的基础。动物中心将自己保种生产的B6与CBA杂交一代作为哨兵鼠，此鼠所有需要排除的病原均为阴性。每周换笼时从所在检测笼架每一个笼盒内用镊子取一撮脏垫料集中在一起作为哨兵鼠的垫料，脏垫料接触至少8周后进行第三方检测和自检。对于检测结果阳性的哨兵鼠，需要进一步对所在笼架进行抽查，最终确定病原感染笼盒，并进行隔离，安排生物净化或淘汰。对于发现的疑似感染动物，要紧急进行隔离，做好接触环境和饲养笼具的彻底消毒，做到早发现、早隔离、早净化，防止污染、防止进一步扩散。
2.5严把“医护关”，确保动物实验项目顺利开展和保障动物福利
实验动物在实验过程中由于建立模型操作和受环境因素的影响可能会出现健康问题，特别要高度重视疑似微生物感染，因为微生物感染所造成的健康问题存在感染其他动物和人的风险。动物中心现有小鼠笼位2万多笼，很难实施兽医每天的巡查。因此，有效的方案是：兽医培训实验人员和饲养工作人员识别动物健康状况，出现紧急情况时，如发现动物死亡或濒临死亡、大面积皮肤外伤等，须及时向兽医报告。其他一些非紧急的动物健康问题使用红色的兽医照料特殊笼牌记录，兽医重点巡查红牌笼盒的动物状况。此举极大地提高了动物医护效率。对紧急的动物健康问题，遵照生物安全操作流程，对接触环境进行消毒处置，将动物进行隔离检疫，对死亡或濒死动物在生物安全柜进行剖检。剖检流程主要是进行体表观察、采血检测、大体解剖、病变器官组织取样切片诊断。由主治兽医初步诊断，写剖检报告，提交给实验者。对巡检出现的问题，由兽医现场指导实验人员进行护理。对于死亡的动物尸体或者实验剩余的动物器官样本，则严格按照医疗废弃物处理办法，由专门持有资质的医疗废物处理机构进行处理[15,17]。兽医每周的巡检，将兽医诊断和照片汇总后邮件发给相应的实验者和实验室负责人，做出进一步的处置。IACUC授权兽医对出现健康问题的动物进行处置，确保动物得到及时的医护，疑似传染性疾病得到及时的控制。
2.6严把“技术关”，确保动物中心专业技术服务支撑水平达到世界一流
技术高水平、服务高效率的人才队伍建设是动物中心良性发展的基础，因此动物中心十分重视人才队伍的培养。在学校实验室管理处及生命学科校级平台的共同支持下，建立了多项人员考核制度，实施趋同化管理，基本做到了人员稳定，核心技术人员不流失。为了能保证实验动物专业技术服务水平达到世界一流，动物中心每年对技术员提供不少于两次的行业内技术交流及培训。核心技术人员参加国际交流和实验动物专业技术学习培训，不断更新知识，增强再学习能力，保持核心竞争力。
3结语
安全无小事，实验室获得性病原体传播属重大公共安全事件，其发生更是因为隐蔽性强、传播快、范围广，发现和检测具有延迟性等特点，容易引起人们的恐慌心理，因此做好实验动物各种生物安全风险的评估，制定生物安全防范的措施和严格的监管制度显得尤为重要。动物中心虽起步较晚，但提速较快。运行10年来，实验动物生物安全预防措施和监管得到了学校实验室管理处、生命科学学院、IACUC和北京市实验动物管理办公室的悉心指导和帮助，各项实验动物生物安全防疫工作管理制度逐步得到完善和落实，形成了一套具有学校特点、严密的防止动物疫情发生和对动物进行医护的管理制度和有效措施。动物中心也将根据实验动物研究的发展，进一步提升有效的生物安全应急预案和预防措施，防患于未然，对紧急发生的生物安全问题及时控制，提升人员职业健康保护和对动物健康问题的诊断和医护能力。经过10年的发展，动物中心已成为全国较为有影响力的实验动物专业技术服务支撑平台，其设施设备投入、团队建设和管理运行模式等正在引领国内高校和研究机构实验动物质量的进一步发展。资源合作共享、经验交流互通，在建设世界一流大学的征程上，实验动物中心也按照世界一流的实验动物研究设施要求，全面提升实验动物专业技术服务水平和科研支撑能力，助力学校生医药等交叉学科研究水平的快速健康发展。做好实验动物防疫工作，实现安全管理，才能保障动物相关教学、科研有条不紊地进行。希望我们的探索和尝试可为其他高校实验动物的生物安全管理提供参考和借鉴，互相学习，共同提高。